单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism,SSCP)是一种分离核酸的技术,可以分离相同长度但序列不同的核酸(性质类似于DGGE和TGGE,但方法不同)。
原理
单链构象多态性(Single-strand conformation polymorphism,SSCP)分析可以检测脱氧核糖核酸序列之间的不同。SSCP首先由Lee 等用于研究自然微生物群体的多样性。在低温条件下,单链DNA呈现一种由内部分子相互作用形成的三维构象,它影响了DNA在非变性凝胶中的迁移率。相同长度但不同核苷酸序列的DNA由于在凝胶中的不同迁移率而被分离。迁移率不同的条带可被银染或者荧光标记引物检测,然后用DNA自动测序进行分析。用PCR-SSCP技术可以进行序列差异的测定,而敏感度会随着片段长度的增加而降低。但是只要条带被凝胶电泳分离开就可以进行系统发育的研究。在Schmalenberger和Tebbe的研究中,测序技术表明一个单链也许包括多种序列,电泳条件也会因此影响基因结构的确定进而影响生物多样性的研究。在非变性条件下,单链核酸分子由于分子内序列互补,可形成二级和三级结构,即不同构象。在凝胶电泳中,未变性的单链核酸分子通过以下性质分离:链长、分子间相互作用以及一级结构的变化,即某些位点的一个核苷酸发生改变也可能影响整个构象。
实验步骤
利用PCR从提取出的脱氧核糖核酸中扩增16S rRNA基因。利用λ-外切核酸酶消化掉一条链(其中一个PCR引物被磷酸化,这条链将被去除)。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
应用
单链构象多态性可用于预筛选克隆文库。可对其中的某一个条带进行测序,并与数据库中已知序列比对。