电泳(electrophoresis)是在电场作用下,带电颗粒向其对应的电极方向,以一定的速度进行泳动,使组分分离成狭窄区带的一种技术。电泳是俄国物理学家Reuss于1807年首次发现的。在物理化学中,电泳的定义是荷电的胶体粒子在电场中的移动。
当把一个带电颗粒放入电场时,便受到一个驱动力作用而使带电颗粒在电场中以一定的速度向一定方向泳动迁移。原则上按电泳的原理来分即可分为移动界面电泳、区带电泳和稳态电泳或称置换(排代)电泳。
电泳技术广泛应用于生物医学、生物化学、生物物理学等领域,还有食品、农业、卫生和环保等领域,如骨髓瘤肾病的早期诊断,A-PAGE电泳方法鉴定豇豆品种,无铅阴极电泳涂料A。
定义
电泳(electrophoresis)是电解质中带电粒子在电场的作用下,以不同的速度向电荷相反方向迁移的现象,受电场强度,溶液离子强度,溶液pH值等因素的影响。许多重要的生物分子如氨基酸、多脑、蛋白质、核甘酸、核酸等都含有可解离基团,在非等电点条件下均带有电荷。在电场力作用下,它们会向着与其所带电荷相反的电极移动。
电泳技术
利用电泳现象使物质分离,这种技术也叫做电泳。电泳技术就是利用电场的作用,由于待分离样品中各种分子在带电性质以及分子形状、分子大小等性质方面存在一定的差异,所以带点分子在电场中的迁移速率不同,从而对样品进行分离、鉴定与纯化的技术。
电荷移动规律
利用电泳可以确定胶体微粒的电性质,向阳极移动的胶粒带负电荷,向阴极移动的胶粒带正电荷。一般,金属氢氧化物、金属氧化物等胶体微粒吸附阳离子,带正电荷;非金属氧化物、非金属硫化物等胶体微粒吸附阴离子,带负电荷。
电泳原理
电泳就是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象,也称电迁移。不同带电颗粒因其电荷量不同,在同一电场中的泳动速度也就不同,其泳动速度用迁移率(或称泳动度,mobility)来表示。带电粒子受到电场的力后,由于本身的电性、形状、大小等导致受到不同,移动速率也不相同,导致移动速度不同。
电泳产生的基本原理有两点:
1、物质本身带电:物质分子在正常情况下一般不带电,即所带正负电荷量相等,故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下,某些物质分子会成为带电的离子(或粒子)。不同的物质,由于其带电性质、颗粒形状和大小不同,在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同,因此可使它们分离。
2、电泳迁移率与其所带电荷、带电粒子半径和黏度系数有关:带电粒子在电泳过程中,将受到方向相反的两个作用力,是起推动作用的电场力,另一个是起阻碍作用的,当带电粒子在电场中以恒定速度移动时,由可得式,该电场力于摩擦力大小相等,方向相反,根据斯托克方程摩擦力进一步推导可知,电泳迁移率与所带电荷成正比,与带电粒子半径和黏度系数成反比。电泳迁移率的用途在于被分离在相同电场强度各组分迁移率差别越大,分离效果越好。
分类
移动界面电泳
自由电泳不使用支持介质,电泳在溶液中进行。这类电泳又分为非自由界面电泳和自由界面电泳两类。非自由界面电泳指悬浮在溶液中的带电粒子(如各种细胞)通电后全部移动,不出现界面,如显微电泳等。自由界面电泳中被分离物质集中在某一层,形成各自的界面而进行定性或定量分析。
区带电泳
不同的蛋白质,它们的分子大小及分子形状都不同。因此,在一定pH的缓冲液中所带电荷的多少也不相同,由此在同一电场下,各种蛋白质的移动速度亦各不相同。经过一定时间后,即可根据其移动速度的不同分离成若种成分。这样不同的蛋白质就可以此分开。如果把蛋白质放在惰性支持物上进行电泳,不同蛋白质就形成带状区间,这种电泳就称为区带电泳。
分类
电泳技术中以区带电泳的应用比较广泛。区带电泳可用各种类型的物质作支持介质或称支持物。因所用支持物种类、黏度大小、电泳方式、电泳板的厚度及用途等不同又可以进行不同的分类。
按支持物物理性状不同
区带电泳可分为:①滤纸及纤维素膜电泳:如食用醋酸纤维膜玻璃纤维膜等;②粉末电泳:指用非凝固性的粉末作支持物的电泳,如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳;③凝胶电冰:北丝桃人造丝等作支持物的电泳,属微量电泳胶电泳;④丝线电泳:如用尼龙丝、人造丝等作支持物的电泳,属微量电泳技术。
按支持物的装置形式不同
区带电泳可分为:①水平板式电泳:支持物水平放置;②垂直板式电泳:支持物垂直放置,呈板状;③圆盘式电泳:垂直圆胶管;④连续流动电泳泳:支持物垂直竖立,两边各放一电极,缓冲液和样品自顶端下流,与电泳方向垂直,可分离较大量的蛋白质。
按pH的连续性不同
区带电泳可分为:①连续pH电泳:电泳的全部过程中缓冲液pH保持不变;②不连续pH电泳:缓冲液和支持物间有不同的pH,能使分离物质的区带更加清晰,并可对极微量的物质(10'g级)进行分离。
稳态电泳
稳态电泳是带电分子颗粒在电场的作用下迁移一段时间后达到稳态,电泳条带的宽度不随时间变化而变化的电泳过程。如等电聚焦,等速电泳。
等电聚焦
等电聚焦(isoelectricfocusing,IEF)电泳是利用pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质。由于其分辨率可达0.01pH单位,因此特别适合分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。
两性电解质在具有pH梯度的介质中电泳,当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷,向负极移动;若其处在高于其本身等电点的环境中,则带负电向正极移动;当泳动到其自身特有的等电点时,其净电荷为零,泳动速度下降到零,具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置,形成一个个清晰的区带,分辨率极高。常用的pH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等,其中聚丙烯胺凝胶为最常应用。
影响因素
电场强度
电场强度(V/cm)指每厘米的电势降。一般而言,电场强度越大,电泳速率越快。但随着电场强度增大,电流也增大,从而造成电泳过程产生的热量增多,最终导致介质温度升高,诱发一系列不利影响的产生,而降低电流强度,可以减小产热,但会延长电泳时间,从而导致生物大分子扩散增加,同样影响分离效果。
生物大分子的性质
待分离生物大分子所带电荷的多少、分子大小和物理化学性质都会对电泳产生明显影响。一般而言,大分子所带电荷越多、直径越小、形状越接近球形,其电泳迁移速率越快。
溶液离子强度
一般电泳还要求缓冲液的离子强度维持在一定范围之间(0.02~0.2),离子强度过低则缓冲能力差,但离子强度过高则会形成较强的离子扩散层(即离子氛),引起电泳速率降低。溶液的离子强度越高,颗粒运动速度越慢,反之,则越快。一般最适的离子强度为0.02~0.2。所以选用缓冲溶液,不但要考虑其pH,还要考虑其离子强度。离子强度Ⅰ可用下式进行计算:
I——离子强度、c——离子的物质的量浓度、z——离子的价数。
溶液的pH
溶液的pH决定了溶液中带电颗粒的解离程度,也决定了颗粒所带净电荷的多少。对两性电解质,溶液pH还决定了带电颗粒的电性,当pH\u003cpl(等电点)时,颗粒带正电,向负极移动;当pH\u003epl时,颗粒带负电,向正极移动;当pH=pl时,颗粒所带的正负电荷相等,净电荷为零,在电场中不移动。
电渗(electro-osmosis)
在电场中,液体对固体的相对移动,称为电渗,如图所示。例如:滤纸表面有带负电荷的羧基,而与滤纸相接触的水溶液则带正电荷,所以滤纸表面的水溶液会向负极移动。由于电渗现象与电泳现象同时存在,所以电泳的粒子移动距离也受电支持物渗影响,如果颗粒移动的方向与电渗现象的方向相反,则颗粒的实际泳动距离=电泳移动距离电渗距离;如果电泳方向与电渗方向一致,则颗粒的实际泳动距离=电泳移动距离+电渗距离。电渗现象所造成的移动距离可以用不带电的有色染料或有色葡聚糖点在支持物中间,就能观察电渗的方向和距离。
其它
缓冲液的黏度以及温度等也对颗粒的泳动速度有一定影响。
应用
医用领域
临床疾病判断
新鲜血清经电泳后可精确地描绘出患者的蛋白质,一般常见的是白蛋白降低,某个球蛋白区域升高,提示不同的临床意义。血清蛋白质醋纤膜电泳在临床上常用于分析血、尿等样品中的蛋白质,供临床上诊断肝、肾等疾病参考。例如肾病综合征患者,由于小分子量的血浆白蛋白漏出并随尿液排出体外,导致醋纤膜电泳图谱中白蛋白区带明显变小变浅。又如,慢性肝炎和肝硬化患者,由于肝细胞受损,肝脏合成血浆蛋白质的能力大大降低,使血浆白蛋白显著降低,γ球蛋白相对增加。血清蛋白质醋纤膜电泳对多发性骨髓瘤、骨髓瘤肾病这类疾病的早期诊断,疗效观察和预后判断均有十分重要的意义。
与免疫技术结合
让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运行方向,从而加快了沉淀反应的速度。免疫电泳技术的种类很多,如:对流免疫电泳(CIEP)、免疫亲和毛细管电泳(IACE)、电免疫扩散(EID)等,
心、脑血管独立的危险因子的检测
该技术是利用抗原、抗体反应将电泳分离的脂蛋白加以鉴别。血清经琼脂糖凝胶电泳,再经染色后可出现不同脂蛋白的条带。该方法既可予以半定量,又能将胶片保存便于比较,能提高对心、脑血管独立的危险因子检测的敏感性和特异性。
工业领域
新型耐候电泳漆
新型耐候电泳漆由ep和聚丙烯酸组成,可以保证电泳漆既具有防腐性又具有一定的耐老化性。高泳透力薄膜电泳漆在降低外板膜厚的同时,提高了内板及盒装结构的膜厚,进而提高了整车的耐腐蚀性能。新型耐候电泳漆使车轮涂层结构由原来的电泳+金属面漆双涂层变为一层阴极电泳涂层,降低了生产成本,且释放了面漆产能,解决了面漆涂装生产的瓶颈问题。
其它
A-PAGE电泳方法鉴定豇豆品种
许多作物种子可用醇溶蛋白PAGE进行品种鉴定,经改进ISTA醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对豇豆种子进行品种真实性鉴定。该方法设备简单、节约试剂、技术先进、手续简便,且快速高效、分离效果好、容易掌握,为快速鉴定豇豆品种提供重要的参考依据。
历史
1807年斐迪南·弗雷德里克·罗伊斯(Reuss)在研究胶体颗粒时发现,电解所需的产物不是直接释放在电极上,而是使它们不同的运动同步受阻在两个电极间的中间位置上,它能分离非常类似的物质,包括不同的蛋白质,提高了分析和制备的效果。1937年,阿尔内·蒂塞利乌斯(ArneTiselius)教授利用电泳现象发明了最早期的界面电泳(movingboundary)用于蛋白质分离的研究,开创了电泳技术的新纪元,他因此获得1948年诺贝尔化学奖。1950年以来,区带电泳开始在纸上和聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上应用,1960年以后,圆盘和顶替电泳(等速电泳)以及等电点聚焦又提供了许多提高分辨率的方法。20世纪80年代后期,毛细管电泳是分析化学,特别是生物分析化学领域的重大研究进展,也是90年代最有影响的分离手段之一。
测量仪器
电泳槽
电泳槽是电泳系统的核心部分,根据电泳的原理,电泳支持物都是放在两个缓冲液之间,电场通过电泳支持物连接两个缓冲液。不同电泳采用不同的电泳槽,常用的电泳槽有(1)圆盘电泳槽:有上,下两个电泳槽和带有铂金电极的盖。上槽中具有若干孔,孔不用时,用硅橡皮塞塞住.要用的孔配以可插电泳管(玻璃管)的硅橡皮塞。电泳管的内径早期为5~7mm,为保证冷却和微量化,现在则越来越细。(2)垂直板电泳槽:垂直板电泳槽的基本原理和结构与圆盘电泳槽基本相同。差别只在于制胶和电泳不在电泳管中,而是在块垂直放置的平行玻璃板中间。(3)水平电泳槽:水平电泳槽的形状各异,但结构大致相同。一般包括电泳槽基座,冷却板和电极。
电源
要使荷电的生物大分子在电场中泳动,必须加电场,且电泳的分辨率和电泳速度与电泳时的电参数密切相关。不同的电泳技术需要不同的电压,电流和功率范围,所以选择电源主要根据电泳技术的需要,如聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS电泳需要200~600V电压。