底物水平磷酸化（substrate level phosphorylation）是指代谢物在氧化分解过程中脱氢氧化时，分子内能量重新分布，集中较高的自由能，形成了某些高能磷酸键，它可转移给ADP形成ATP。这种底物分子氧化反应与磷酸化反应偶联生成ATP的反应过程称为底物水平磷酸化。人体内通过底物水平磷酸化生成ATP的量只占体内ATP生成总量的5％以下。
底物磷酸化是生物氧化生成ATP的次要方式，但在发酵作用中是进行生物氧化取得能量的唯一方式。底物水平磷酸化不依赖于氧气，在有氧和无氧条件下都能进行，其意义在于它是无氧条件下兼性生物细胞或厌氧微生物从有机化合物取得生物所需能量的主要来源。
名词解释
底物水平磷酸化（substrate level phosphorylation）：是指物质在脱氢或脱水过程中，产生高能代谢物并直接将高能代谢物中能量转移到ADP(GDP)生成ATP(GTP)的过程。
指在分解代谢过程中，底物因脱氢、脱水等作用而使能量在分子内部重新分布，形成高能磷酸化合物，然后将高能磷酸基团转移到ADP形成ATP的过程。例如在糖的分解代谢过程 中，甘油醛-3-磷酸脱氢并磷酸化生成甘油酸1，3-二磷酸，在分子中形成一个高能磷酸基团，在酶的催化下，甘油酸-1，3-二磷酸可将高能磷酸基团转给ADP，生成甘油酸-3-磷酸与ATP。
又如甘油酸-2-磷酸脱水生成烯醇丙酸磷酸时，也能在分子内部形成一个高能磷酸基团，然后再转移到ADP生成ATP。
又如在三羧酸循环中，琥珀CoA（辅酶A）生成琥珀酸，同时伴有GTP的生成，也是底物水平磷酸化。
特点
底物水平磷酸化指高能化合物的放能水解作用或与基团转移相偶联的ATP合成作用。不包括光合磷酸化或呼吸链中氧化磷酸化的ATP生成过程。例如：糖酵解途径中产生的高能磷酸化合物甘油酸1，3-二磷酸和烯醇式磷酸丙酮酸在酶的作用下，高能磷酸基团转移到ADP分子上生成ATP。又如三羧酸循环中产生的高能硫化合物琥珀酰辅酶A在酶的作用下水解成琥珀酸，同时使GDP磷酸化为GTP，GTP再与ADP作用生成ATP。这些都是底物水平磷酸化的实例。底物水平磷酸化没有共同的作用机制。
差别
对于
1. 氧化磷酸化偶联 在生物氧化过程中，代谢物脱下的氢经呼吸链氧化生成水时，所释放出的能量用于ADP磷酸化生成ATP。氧化是放能反应，而ADP生成ATP是吸能反应，这两个过程同时进行，即氧化时偶联磷酸化的过程称为氧化磷酸化。这种方式生成的ATP约占ATP生成总数的80%，是维持生命活动所需能量的主要来源。
2. 电子传递链中ATP形成的部位
3. 影响氧化磷酸化的因素
（1）ATP与ADP的调节作用： ADP/ATP比值下降，说明细胞储备ATP较多，所以氧化磷酸化速度缓慢甚至停止。反之这个比值升高说明细胞需要ATP，于是氧化磷酸化加速进行。
（2）甲状腺素的调节作用：导致氧化磷酸化增强，促进物质氧化分解代谢，结果耗氧量和产热量均增加。故甲状腺机能亢进的病人常出现基础代谢率（BMR）增高、怕热，易出汗等症状。
（3）氧化磷酸化的抑制剂：氧化磷酸化的抑制剂主要有两类：一是抑制电子传递的抑制剂（呼吸链抑制剂）；另一类是使氧化磷酸化拆离的解偶联剂。呼吸链抑制剂的作用与一定部位的电子传递体结合而阻碍其电子传递。
氧化磷酸化解偶联剂不影响呼吸链的电子传递，但能减弱或停止ATP合成的磷酸化反应。最常见的解偶联剂是2，4-2-硝基苯酚（DNP）。